饶子和、王权、龚鹏团队：新冠病毒聚合酶催化机制 | CellPress对话科学家

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2020年1月31日，Cell Press新型冠状病毒中英双语资源中心正式开放。您可以在该资源中心页面上查找到COVID-19相关论文的投稿政策，以及Cell Press旗下期刊已发表的有关疫情和病毒的论文。网站正在不断更新中，所有内容都可以免费阅读，点击查看。

最新在中心上线的发表在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell上研究论文"Structural basis for RNA replication by the SARS-CoV-2 polymerase"，由上海科技大学免疫化学研究所饶子和、王权以及中国科学院武汉病毒研究所龚鹏科研团队共同攻克，该研究解析了新型冠状病毒RNA聚合酶及其辅助因子与RNA和抗病毒候选药物瑞德西韦复合体2.9 Å的三维结构，揭示了新型冠状病毒RNA聚合酶复合体催化过程中“转位前”和“转位后”两个生理状态的构象特征。

Cell Press细胞出版社微信公众号对该论文进行了解读并同时采访了论文第一作者和通讯作者王权和饶子和教授，旨在与广大科研人员分享该研究成果以及一些未来的展望，点击“阅读原文”或识别下图二维码阅读英文原文。

*以下中文内容仅供参考，请以英文原文为准。

研究介绍

尽管新型冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶nsp12与药物相互作用的机理尚未完全明确，但瑞德西韦和法匹拉韦等核苷酸类似物抑制剂，已在体外实验和一些临床研究中显示出了初步的治疗COVID-19的希望。在此，我们使新型冠状病毒RNA聚合酶复合物稳定暂停于催化过程中的“转位前/后”状态，并研究了其低温电子显微结构，从而探究了新型冠状病毒RNA复制的分子基础。结构显示，与未结合核酸底物的apo复合物相比，nsp12及其辅因子nsp7 / nsp8发生了显著的结构重排以适应核酸的结合。而且nsp12中存在高度保守的氨基酸残基，可稳定模板和引物链核酸，以使其能够与后续结合的核苷酸精确反应。此外，通过结构和酶活动力学分析，我们探究了瑞德西韦三磷酸代谢产物的抑制机制。我们还提出了从nsp7-nsp8十六聚体引物酶复合物到nsp12-nsp7-nsp8聚合酶复合物的过渡模型，为理解冠状病毒转录/复制机制提供了线索。

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作者专访

Cell Press细胞出版社特别邀请饶子和教授、王权教授

进行了针对该研究的专访，为大家进一步详细解读。

CellPress：

请简单介绍一下研究背景和初衷。

饶子和教授、王权教授：

首先，我们研究团队自十七年前“非典”（SARS）疫情后，就一直持续地关注冠状病毒作为一种潜在再发性传染病病原的可能。在2012年中东呼吸综合征（MERS）疫情之后，冠状病毒显然已经从一种新发传染性病原逐步转变为一类对人类社会产生持续威胁的再发性传染病病原。考虑到RNA病毒遗传物质的不稳定性，特别是刺突蛋白（spike protein）等病毒表面的结构蛋白在跨种传播过程中往往要经历难以预期的遗传突变，我们团队主要关注于相对“不变”的病毒转录复制相关的非结构蛋白质。由于病毒转录复制机制在进化上相对较高的遗传保守性以及其对病毒复制扩增的至关重要性，相关蛋白质一般也被认为是广谱抗病毒药物的优秀靶标，相应的靶向药物是应对未来潜在流行毒株的重要策略。

CellPress：

研究团队分析了RdRP催化复合物在不同状态下的构象，这种构象转换在病毒的转录与复制中有什么作用？

饶子和教授、王权教授：

RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）是冠状病毒遗传物质转录复制复合体的核心组分，它也被称为第12号非结构蛋白（nsp12），被认为能够与其他多个非结构蛋白质组装形成一部高效的RNA合成“机器”，完成病毒遗传物质的转录复制过程。我们此前的工作(Gao et al., 2020) 表明非结构蛋白nsp7和nsp8能够与nsp12形成较为稳定的复合体，并且对RdRP的RNA合成活性有显著的促进(Subissi et al., 2014; Wang et al.) ，但是并没有观测到nsp7/nsp8与RNA或者nsp12的催化核心有明显的相互作用，其生理意义及相应的结构基础一直扑朔迷离。我们的这项工作，捕捉了RdRP/nsp7/nsp8复合体催化过程中“转位前”和“转位后”两个生理状态的构象特征，特别是在“转位后”状态结构中，结构捕捉了RNA复制反应进入稳定延伸阶段后，与nsp12单独直接结合的以及通过nsp7介导与nsp12结合的两个nsp8分子N端结构域的大幅构象变化。两个nsp8分子的N端交汇形成一个产物RNA向上游退出路径上的一个结构性平台，发挥潜在的稳定RNA转位和帮助其快速行进的作用，充分阐释了非结构蛋白nsp7和nsp8作为RdRP辅助因子的生理意义和结构基础。

▲图1  RdRP/nsp7/nsp8复合体催化过程中“转位前”状态下的两种构象

CellPress：

活性三磷酸形式的瑞德西韦(RDV-TP)是如何抑制病毒RNA聚合的？为什么单磷酸形式的瑞德西韦不具有这种能力(RDV-MP)？

饶子和教授、王权教授：

在“转位后”复合体中，我们观察到瑞德西韦三磷酸形式的效应分子（RDV-TP）作为一种腺嘌呤类似物成功经历RdRP的催化“混入”了产物RNA中，并且完成了向上游的转位。我们利用进一步的生化活性数据与结构结果相支撑，验证了瑞德西韦通过“混入”RNA产物并与上游产物RNA退出通道中关键氨基酸（Ser861）的位阻效应发挥迟滞RNA复制反应的“延迟终止”（delayed chain-termination）抑制机制。当然，需要注意，在我们的体外实验条件下，也同时观测到在后续底物核苷酸浓度较高的情况下有少量比例的反应能够突破这个位阻效应。至于为什么单磷酸形式的瑞德西韦（RDV-MP）不具有这种能力，这主要是由RNA合成过程中核苷酸缩合反应的化学机制所决定的，单磷酸形式的核苷酸或核苷类似物无法参与这样的反应进入RNA产物，同时根据此前对其他聚合酶的研究表明，单磷酸形式的核苷酸或核苷类似物甚至无法有效抵达或结合到反应位点。

▲图2  聚合酶与RNA复合体转位前状态的三维结构及瑞德西韦效应分子通过RNA聚合酶“混入”病毒RNA产物链中并与上游产物RNA退出通道中关键氨基酸（Ser861）之间的潜在位阻效应

CellPress：

参与病毒RNA结合的残基以及包含催化活性位点的残基（nsp12）都是高度保守的，这说明了什么？

饶子和教授、王权教授：

这实际上并不意外，是nsp12整体序列进化保守性的一种微观体现。一方面进一步说明RNA复制过程的精密性和机制的稳定性，另外一方面，也说明大量致力于靶向nsp12的药物研发策略是有合理性的，并且很可能是开发广谱抗病毒药物应对潜在毒株进化突变的有效手段。

CellPress：

发现nsp7-nsp8复合物向nsp12-nsp7-nsp8复合物过渡的模式为我们理解病毒的转录和复制机制提供了怎样的帮助？

饶子和教授、王权教授：

需要明确的是，这不是我们实验真实发现的模式，这是一个我们根据现有结构信息推测的一种可能的猜测模型。冠状病毒一个显著特征就是其长约30kb的巨大RNA基因组，同时其相应进化出了一套颇为复杂、完备、高效的基因组转录复制系统。我们多年前的研究捕捉了nsp7和nsp8形成的一种十六聚体环状复合物 (Zhai et al., 2005)，中间孔洞恰好能够容纳一条双链RNA，体外活性研究表明nsp8具备依托模版从头合成产物RNA的引物酶活性，该十六聚体从而被认为是一种功能上处在nsp12上游的引物酶复合体。我们此次的研究发现，聚合酶复合体中结合于nsp12上的一对nsp7/nsp8在空间相对位置和结合形式都与其十六聚体形式引物酶复合体中的一对nsp7/nsp8颇为相似。这引起我们的直觉思考，有可能是这一对nsp7/nsp8在引物酶反应后期，作为分裂成半环状或者进一步完全解体后的引物酶复合体的残留部分招募了nsp12的结合，并留存下来与nsp12共同形成了下一阶段的聚合酶复合体，共同完成RNA的高效复制。虽然这个模型基本是基于这个领域比较接受的结构比较方式和共识性的前序实验结果实现的，但是否是真实的，还需要我们下一步工作的小心求证。不过希望这个模型能够将大家的视野从nsp12-nsp7-nsp8这个复合体带到冠状病毒转录复制机制这个更为宏大复杂的时空场景下，在这个场景下有更多功能特异的酶分子和其相互作用网络可以作为潜在的抗病毒药物设计靶点。

▲图3 Nsp7-nsp8引物酶复合物向nsp12-nsp7-nsp8聚合酶复合物转换的简略模型

CellPress：

本研究中的构象Ⅰ可能是一个过渡状态，为什么？

饶子和教授、王权教授：

德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所 Patrick Cramer院士研究组与我们同一天投稿了一篇探究新型冠状病毒聚合酶复合体与RNA相互作用模式的论文(Hillen et al., 2020)。他们虽然没有能够像我们的工作中那样通过将“工作中”的复合体暂停在催化反应过程中的某一阶段而获得催化状态的“功能复合体”，而是通过将三段可以利用回文序列接续延长的RNA拼接形成的更长的核酸（24bp）与聚合酶复合体进行孵育，捕获了与我们工作中观察到的构象II类似的一个状态。由于构象I和构象II中观察到的nsp8 N端与上游RNA相互作用的特征是随着反应进行和上游RNA的延长而观察到的，那么这个现象也就更可能是受上游RNA产物的长度所驱动的。考虑在Cramer研究组更长的核酸存在下，其主要观察到了构象II，而没有观察到构象I，那么这或许提示随着反应的进行和更长的上游核酸的出现，构象II更可能是一个后段的稳定状态，而构象I则可能是产物还没有达到一定长度的情况下的一种过渡状态。

▲图4 Nsp12-nsp7-nsp8“转位前“复合体构象I向构象II潜在的变换过程

CellPress：

这些发现为针对SARS-CoV-2的疫苗靶点的确定提供了哪些帮助？

饶子和教授、王权教授：

针对转录复制系统等非结构蛋白的研究更多时候主要是为研究小分子抗病毒药物提供基础但直接的信息，比如瑞德西韦和法匹拉韦等抗病毒候选药物预期就是直接靶向聚合酶的，我们提供的高分辨率结构信息，一方面能够为此类核苷类似物药物的优化设计（比如增加特异性而降低脱靶和副作用等）提供信息，一方面也能够为靶向蛋白间相互作用（比如nsp7/nsp8与nsp12之间）等其他策略的小分子筛选和设计提供思路。此外，考虑到冠状病毒作为一种再发性传染病病原，其表面结构蛋白往往会经历难以预期的颇为频繁的遗传突变，包括现在被用来作为主要的疫苗研发抗原的刺突蛋白，小分子抗病毒药物在远期阶段依然是抵抗病毒的重要方案，是对疫苗的重要补充。另外一方面，随着疫苗工业的发展和技术的进步，减毒疫苗的设计也越来越成为可能，未来通过干预转录复制系统或者其他非结构蛋白的活性或功能而降低病毒的复制效率或毒力，或许是未来制备减毒活疫苗的一种策略。当然，这同样要以我们对病毒众多非结构蛋白的形态和多种生理功能的深入认识为基础。

CellPress：

研究过程中遇到了哪些困难，是如何解决的？介绍一下未来研究深入计划。

饶子和教授、王权教授：

必须承认，这是一项颇为挑战性的工作，除了我们团队此前对这个病毒的一些认识上的积累和相应研究技术手段上的沉淀，依然有不少困难点。但很幸运，随着我国整体科研能力的提升，我们在各方面都能获得同行的支持，比如合适的用于组装稳定复合体的RNA以及相应的活性检测体系就获得了我们合作者中国科学院武汉病毒研究所副所长龚鹏研究员的支持，而用于研究瑞德西韦药效机制的瑞德西韦三磷酸形式效应分子则是由我们在上海科技大学免疫化学研究所的同事姜标教授和杨小宝助理研究员合成的。此外，这项工作基本是在疫情期间完成的，除了学校各级领导和校园服务部门对我们团队提供了重要的实验物资供应和安全保障外，学校的生物电镜平台、免疫化学研究所的科研平台以及毗邻的国家蛋白质科学中心上海设施也给团队提供了强有力的软硬件支持，技术工程师提供了有效的远程协助和指导，可以说是大家一同完成了这项研究。

最后，可以注意到，由于国家抗疫工作整体上的成功，为包括科学研究在内的各项工作的有序开展提供了良好的社会支持，截止5月底国内同行在包括Cell在内的顶级期刊已经发表30余篇新型冠状病毒的相关研究成果，未来一段时间我们希望能够与这些同行在病毒转录复制更为深入的机制方面以及相应的小分子抗病毒药物的发现和开发方面继续合作。

本文参考文献（上下划动查看）

1 Gao, Y., Yan, L., Huang, Y., Liu, F., Zhao, Y., Cao, L., Wang, T., Sun, Q., Ming, Z., Zhang, L., et al. (2020). Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus. Science.

2 Hillen, H.S., Kokic, G., Farnung, L., Dienemann, C., Tegunov, D., and Cramer, P. (2020). Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature.

3 Subissi, L., Posthuma, C.C., Collet, A., Zevenhoven-Dobbe, J.C., Gorbalenya, A.E., Decroly, E., Snijder, E.J., Canard, B., and Imbert, I. (2014). One severe acute respiratory syndrome coronavirus protein complex integrates processive RNA polymerase and exonuclease activities. Proc Natl Acad Sci U S A 111, E3900-3909.

4 Wang, Q., Wu, J., Wang, H., Gao, Y., Liu, Q., Mu, A., Ji, W., Yan, L., Zhu, Y., Zhu, C., et al. Structural basis for RNA replication by the SARS-CoV-2 polymerase. Cell.

5 Zhai, Y., Sun, F., Li, X., Pang, H., Xu, X., Bartlam, M., and Rao, Z. (2005). Insights into SARS-CoV transcription and replication from the structure of the nsp7-nsp8 hexadecamer. Nat Struct Mol Biol 12, 980-986

论文通讯作者简介

饶子和

中国科学院院士

饶子和教授主要从事新发、再发传染病病原体的结构与功能研究，以及创新药物的研发。他在新型冠状病毒和SARS冠状病毒、禽流感病毒、甲型肝炎病毒、疱疹病毒、非洲猪瘟病毒等病毒感染、复制和组装，以及结核分枝杆菌能量和代谢物运输、耐药性和细胞壁合成的结构功能研究中做出了重要贡献。在新型冠状病毒爆发期间，他解析了两个主要抗病毒药物靶点―主蛋白酶和聚合酶的三维结构，为认识病毒复制机制和发展抗病毒药物，提供了重要科学基础。迄今为止，他已在国际科学期刊上发表同行评审论文370余篇，其中包括在Science、Nature、Cell三大科学杂志的主刊上发表研究论文18篇，被引用逾16,800次。现任中国科学院学部主席团成员，全国政协常委，清华大学/南开大学教授，上海科技大学特聘教授，南开大学前校长，中国科学院生物物理研究所原所长。

论文第一作者简介

王权

上海科技大学助理教授、研究员

王权教授致力于利用冷冻电子显微技术，研究病原微生物重要生物大分子复合体的组成和结构，以及宿主免疫系统应对病原感染过程中的分子机制。同时开展相关抗感染药物的筛选与研发工作。

相关论文信息

原文刊载于CellPress细胞出版社旗下期刊Cell上

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▌论文标题：

Structural basis for RNA replication by the SARS-CoV-2 polymerase

▌论文网址：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30629-2#

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.034

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中文审校：Cell科学编辑 杨扬

Cell Press冠状病毒资源中心

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